Prosedur Ekstraksi DNA Bakteri

DNA bakteri memiliki struktur helik ganda dan berbentuk sirkuler yang terletak bebas di dalam sitoplasma dan tidak dilapisi membran inti. Selain itu juga terdapat satu jenis DNA tambahan yang disebut dengan istilah Plasmid yang juga berbentuk sirkuler namun ukurannya lebih pendek dari DNA bakteri. Keduanya terdapat di dalam sitoplasma bakteri dan memiliki fungsi masing-masing.

DNA dan Plasmid bakteri dapat diekstraksi dan diisolasi dari komponen lainnya untuk keperluan penelitian di bidang molekuler. Ekstraksi DNA berarti mengeluarkan DNA dan memisahkannya dari komponen-komponen lainnya. Hasil ekstraksi DNA biasanya digunakan untuk keperluan identifikasi spesies bakteri, DNA library, dan Rekayasa Genetik. Terdapat berbagai macam metode dalam melakukan ekstraksi DNA bakteri, yang mana metode ekstraksi DNA bakteri lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan ekstraksi DNA sel eukariot seperti sel hewan, tumbuhan dan jamur.

{tocify} $title={Daftar isi}

Prinsip Ekstraksi DNA Bakteri

Pada prinsipnya ekstraksi DNA bakteri adalah mengambil komponen DNA secara keseluruhan dengan menghancurkan dinding sel dan membran sel. Kemudian organel-organel sel lainnya dibersihkan dan dipisahkan sedemikian rupa sehingga didapatkan DNA murni. Metode ekstraksi DNA bisa dilakukan dengan prinsip fisik, kimiawi maupun kombinasi. Berikut merupakan metode-metode yang biasa digunakan dalam melakukan ekstraksi DNA bakteri.

A. Metode Pemanasan

Metode pemanasan merupakan salah satu metode ekstraksi DNA bakteri dengan prinsip secara fisik. Metode ini cukup sederhana apabila dibandingkan dengan metode ekstraksi yang lainnya. Cara kerja ekstraksinya adalah sebagai berikut:

1. Tambahkan 100 µl air standar molekuler ke dalam microtube.
2. Ambil 5 koloni bakteri menggunakan jarum ose/tusuk gigi steril dan masukkan ke dalam microtube.
3. Inkubasi bakteri dalam block heater pada suhu 100°C selama 10 menit.
4. Tambahkan 900 µl air standar molekuler ke dalam microtube dan dihomogenasi.
5. Sentrifugasi microtube pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
6. Pindahkan supernatan yang mengandung DNA ke dalam microtube baru.
7. Cek keberhasilan ekstraksi DNA dengan metode elektroforesis.

Proses pemanasah dalam metode ekstraksi ini bertujuan untuk menciptakan pori-pori pada membran sel bakteri. Pori-pori pada membran sel terbentuk akibat melemahnya ikatan antar fosfat atau lipid, sehingga menyebabkan komponen-komponen dalam sitoplasma bakteri termasuk DNA akan keluar ke lingkungan. Selanjutnya DNA dan komponen-komponen sel lainnya dipisahkan dengan metode sentrifugasi. Sentrifugasi memisahkan molekul berdasarkan berat jenisnya dengan putaran kecepatan tinggi. DNA memiliki berat molekul rendah akan berada dilapisan bagian atas yang membentuk supernatan.

B. Metode Kimiawi

Metode kimiawi merupakan metode ekstraksi DNA bakteri dengan menggunakan larutan-larutan kimia. Larutan kimia digunakan untuk menghancurkan komponen-komponen sel bakteri selain DNA, seperti karbohidrat, lipid dan protein. Cara kerja ekstraksinya adalah sebagai berikut:

1. Siapkan alat-alat berupa jarum ose, inkubator, microtube, mikropipet dan tip, sentrifus. 
2. Siapkan bahan-bahan yang diperlukan berupa Kultur koloni bakteri 24 jam, Kloroform : Iso-amil alkohol (24:1 v/v) atau  Fenol : Iso-amil alkohol (1:1 v/v), CTAB, RNAse (10 mg/ml), Proteinse K (20 mg/ml), TE (pH 8), SDS 10%, NaCl 5M, air standar molekuler.
3. Masukkan 500 µl TE ke dalam microtube.
4. Ambil 1 ose penuh koloni bakteri menggunakan jarum ose steril, suspensikan ke dalam larutan TE, dan campur hingga homogen.
5. Tambahkan 30 µl SDS 10% ke dalam microtube dan campur hingga homogen.
6. Tambahkan 3 µl Proteinase K ke dalam microtube, kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit.
7. Tambahkan 100 µl NaCl 5M dan campur hingga homogen.
8. Tambahkan 80 µl CTAB dan campur hingga homogen, kemudian inkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit.
9. Tambahkan larutan Kloroform : Iso-amil alkohol atau  Fenol : Iso-amil alkohol sebanyak volume larutan dalam microtube, campurkan hingga homogen, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit.
10. Lapisan bening di bagian paling atas diambil menggunakan mikropipet secara perlahan agar tidak tercampur dengan lapisan bawahnya, dan dipindahkan ke microtube baru.
11. Ulangi langkah 9 dan 10.
12. Tambahkan 50 µg/ml RNAse ke dalam larutan dan inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
13. Ulangi langkah 9 dan 10.
14. Tambahkan NaCl 5M sebanyak 1/10 dari volume larutan dan etanol dingin sebanyak 2x volume larutan, kemudian simpan pada suhu -20°C selama 60 menit.
15. Sentrifugasi microtube pada kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit.
16. Supernatan atau lapisan bening dibuang.
17. Pelet yang menempel di dasar microtube dicuci dengan etanol 70%, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit.
18. Kering-anginkan pelet yang menempel di dasar microtube.
19. Tambahkan 50µl TE ke dalam microtube dan campurkan dengan pelet hingga homogen.
20. Cek keberhasilan ekstraksi DNA dengan metode elektroforesis.

Sumber & Referensi

• Bioted.es : Bacterial DNA Extraction
• Ocw.ehu.eus : Extraction of DNA from Bacteria

Follow

MicrobeHolic Situs berbagi ilmu Biologi dan Mikrobiologi. Silahkan follow situs ini untuk mendapatkan update terbaru.

Share this post