Prosedur Uji Oksidase pada Bakteri

Uji Oksidase adalah uji biokimiawi untuk mengetahui aktifits enzim sitokrom c oksidase yang dihasilkan bakteri. Enzim sitokrom c oksidase adalah enzim yang berperan dalam fosforilasi oksidatif saat proses respirasi seluler sebagai akseptor elektron. Tidak semua bakteri mampu menghasilkan enzim sitokrom c oksidase, karena enzim ini hanya dimiliki oleh bakteri yang melakukan respirasi secara aerobik.

{tocify} $title={Daftar isi}

A. Prinsip dan Kegunaan Uji Oksidase

Enzim sitokrom c oksidase pada bakteri aerobik akan menggunakan Oksigen sebagai akseptor dan pembawa elektron saat proses fosforilasi oksidatif. Enzim ini dapat dideteksi aktifitasnya melalui uji Oksidase menggunakan reagen kimia N, N, N’, N’-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride. Reagen ini menyediakan elektron buatan yang akan bereaksi dengan enzim sitokrom c oksidase. Hasil reaksi oksidase positif akan merubah warna ragen menjadi ungu atau biru tua karena di dalam reagen mengandung senyawa Indophenol Blue. Jika tidak terjadi perubahan warna reagen maka disebut oksidase negatif.

Tidak semua jenis bakteri memiliki karakter uji oksidase positif, karena hanya dimiliki oleh kelompok bakteri aerobik. Sifat ini berguna dalam melakukan identifikasi dalam menentukan spesies bakteri. Contoh genus bakteri dengan karakter uji oksidase positif adalah Neisseria, Moraxella, Campylobacter dan Pasteurella.

B. Macam-Macam Reagen Uji Oksidase Bakteri

Berdasarkan senyawa kimia yang digunakan, reagen uji oksidase bakteri dibagi menjadi 3 jenis yaitu:

Nama Reagen Uji Oksidase	Senyawa Kimia
Kovac's Oxidase	1% tetra-methyl-p-phenylenediamine dihydrochloride dalam air
Gordon dan McLeod’s	1% dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride dalam air
Gaby dan Hadley (indophenol oxidase)	1% α-naphthol dalam 95% ethanol dan 1% p-aminodimethylaniline HCL

C. Prosedur Uji Oksidase Bakteri

Uji oksidase bakteri memiliki beberapa metode yaitu:

• Metode kertas filter
• Metode langsung (direct plate)
  
• Metode ulas (swab)
  
• Metode kertas strip
• Metode tabung reaksi

1. Metode Kertas Filter

• Siapkan kertas filter kering atau kertas Whatman nomer 1 dengan ukuran menyesuaikan sampel yang akan diuji.
• Basahi kertas filter dengan reagen Kovac's Oxidase hingga merata.
  
• Tunggu selama 30 detik agar larutan meresap sempurna.
• Simpan kertas filter di dalam botol gelap tertutup dan kering bekukan  di dalam lemari es, kurang lebih selama 12 - 24 jam.
• Setelah kering keluarkan kertas filter dan letakkan di atas cawan petri.
• Lembabkan sebagaian kertas filter dengan meneteskan akuades steril.
• Ambil koloni bakteri yang akan diuji menggunakan jarum ose platinum atau menggunakan tusuk gigi/tusuk sate steril. JANGAN MENGGUNAKAN JARUM OSE BERBAHAN METAL ATAU BESI karena metal atau besi mudah teroksidasi dan dapat menyebabkan oksidase positif palsu.
• Ulaskan koloni pada permukaan kertas filter pada bagian yang lembab dan amati reaksi perubahan warna.
• Interpretasi uji oksidase metode kertas filter adalah apabila terjadi perubahan warna pada ulasan bakteri menjadi ungu atau biru tua saat pengamatan selama 5-10 detik pertama disebut oksidase positif. Jika perubahan warna terjadi selama pengamatan 10-60 detik maka disebut oksidase positif yang terlambat. Namun jika lebih dari 60 detik baru terjadi perubahan warna atau tidak terjadi perubahan warna dapat dinyatakan oksidase negatif. 

2. Metode Langsung (Direct Plate)

• Siapkan isolat koloni bakteri yang telah ditumbuhkan pada medium agar dalam cawan petri.
• Teteskan 2-3 kali reagen Kovac's Oxidase atau Gordon dan McLeod’s pada koloni yang akan diuji. Usahakan jangan terlalu membasahi koloni.
• Amati perubahan warna yang terjadi pada koloni bakteri.
• Interpretasi uji oksidase menggunakan reagen Kovac's Oxidase adalah jika terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu atau biru tua saat pengamatan selama 5-10 detik pertama disebut oksidase positif. Jika perubahan warna terjadi selama pengamatan 60-90 detik maka disebut oksidase positif yang terlambat. Namun jika lebih dari 2 menit baru terjadi perubahan warna atau tidak terjadi perubahan warna dapat dinyatakan oksidase negatif.
•  Interpretasi uji oksidase menggunakan reagen Gordon dan McLeod’s adalah jika terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu atau biru tua saat pengamatan selama 10-30 menit atau menjadi hitam selama pengamatan 60 menit disebut oksidase positif. Jika tidak terjadi perubahan warna maka disebut oksidase negatif.

 

3. Metode Ulas (Swab)

• Siapkan cotton bud steril.
• Celupkan cotton bud ke dalam reagen Kovac's Oxidase.
• Ulaskan cotton bud ke koloni bakteri yang diuji.
• Amati perubahan warna yang terjadi.
• Interpretasi uji oksidase metode ulas adalah apabila terjadi perubahan warna pada cotton bud menjadi ungu atau biru tua saat pengamatan selama 5-10 detik pertama disebut oksidase positif. Jika perubahan warna terjadi selama pengamatan 10-60 detik maka disebut oksidase positif yang terlambat. Namun jika lebih dari 60 detik baru terjadi perubahan warna atau tidak terjadi perubahan warna maka dapat dinyatakan oksidase negatif.

 

4. Metode Tabung Reaksi

• Siapkan 4,5 ml kultur cair bakteri yang berusia 18-24 jam yang telah ditumbuhkan pada medium Nutrient Broth atau medium lain yang rendah gula dalam sebuah tabung reaksi.
  
• Tambahkan 0,2 ml α-naphthol dan 0,3 ml p-aminodimethylaniline HCL (reagen Gaby dan Hadley) ke dalam kultur cair bakteri.
• Goyangkan tabung reaksi agar tercampur merata.
• Amati perubahan warna yang terjadi.
• Interpretasi uji oksidase metode tabung reaksi adalah apabila terjadi perubahan warna pada kultur bakteri menjadi biru saat pengamatan selama 15-30 detik pertama disebut oksidase positif. Jika perubahan warna terjadi selama pengamatan 2-3 mrnit maka disebut oksidase positif yang terlambat. Namun jika tidak terjadi perubahan warna maka dapat dinyatakan oksidase negatif.

 

D. Interpretasi Uji Oksidase Bakteri

Hasil uji oksidase bakteri dapat dilihat pada gambar-gambar di bawah ini:

Berikut merupakan contoh spesies bakteri yang memiliki hasil positif dan negatif pada uji oksidase.

Hasil Uji Oksidase	Spesies Bakteri
Oksidase Positif	Pseudomonas aeruginosa, Neisseria sp., Actinobacillus lignieresii, Aeromonas spp., Actinobacillus equuli, Pasteurella spp., Bordetella pertussis, Vibrio spp., Bacillus anthracis, Bac. subtillis, Cordiobacterium hominis, Brucella spp., Flavobacterium spp., Chromobacterium spp., Alcaligenes spp., Eikenella corrodens, Moraxella spp., Plesiomonas spp., Campylobacter spp., Branhamella catarrhalis, dan Micrococcus spp.
Oksidase Negatif	Escherichia coli, Staphylococcus spp., Pseudomonas mallei, Streptococcus spp., Pseudomonas maltophilia, Gemella haemolysans, Bordetella parapertussis Peptococcus spp., Actinobacillus, Peptostreptococcus spp., Actinomycetem-comitans, Leuconostoc spp., Anaerobier (tous), Corynebacterium spp., Listeria spp., Pasteurella haemolytica, Lactobacillus spp., Bacillus spp., Streptobacillus sp., Enterobacteriaceae, Mycoplasma spp., dan Acholeplasma spp.

E. Sumber & Referensi

• Cappuccino, J. G. & N. Sherman. 2002. Microbiology: A laboratory manual.
• Eric J. Toone (2006). Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, Protein Evolution (edisi ke-Volume 75). Wiley-Interscience. ISBN 0471205036.
• MacFaddin JF, editor. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd ed. Philadelphia:Lippincott Williams and Wilkins; 2000. p. 363-7.
  
• Madigan, M.T., martinko, J.M., dan Brock, T.D. 2006. Brock biology of Microorganism. Pearson Prentice Hall, New Jersey.
• microbiologie-clinique.com/oxidase-test.html
• microbiologyinfo.com/oxidase-test-principle-uses-procedure-types-result-interpretation-examples-and-limitations/
• microbeonline.com/oxidase-test-principle-procedure-and-oxidase-positive-organisms/
• Nicholas C. Price; Lewis Stevens (1999). Fundamentals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins (edisi ke-Third). USA: Oxford University Press. ISBN 019850229X.
• Patricia Shield dan Laura Cathcart. 2010. Oxidase Test Protocol. American Society for Microbiology.
  

Follow

MicrobeHolic Situs berbagi ilmu Biologi dan Mikrobiologi. Silahkan follow situs ini untuk mendapatkan update terbaru.

Share this post