Pewarnaan Endospora - Prinsip dan Prosedur Pewarnaan

Bakteri secara normal yang hidup di lingkungan normal disebut sebagai sel vegetatif. Artinya bakteri tersebut aktif untuk bereproduksi dengan cara membelah diri untuk menghasilkan keturunan baru. Namun pada kondisi tertentu bakteri dapat bersifat inaktif atau nama lainnya dorman dengan membentuk suatu struktur yang dinamakan endospora.

{tocify} $title={Daftar isi}

A. Definisi Endospora

Endospora adalah bagian dari dinding sel bakteri yang terbentuk oleh aktifitas sporulasi. Sporulasi endospora terjadi ketika bakteri berada pada kondisi lingkungan yang ekstrim. Lingkungan ekstrim seperti temperatur yang terlalu panas atau dingin, zat kimia berbahaya dan sinar radiasi dianggap berbahaya bagi kehidupan bakteri sehinga perlu mempertahankan diri. Bentuk pertahanan bakteri dengan cara membentuk endospora.

Endospora pada bakteri mempunyai ukuran diameter yang beragam, terkadang besar dan terkadang kecil. Endospora yang mempunyai diameter besar menyebabkan sel bakteri tampak membengkak. 

Tidak semua spesies bakteri dapat membentuk Endospora. Endospora hanya dihasilkan oleh spesies bakteri tertentu, contohnya pada genus Bacillus dan Clostridium. Untuk mengetahui ada tidaknya pembentukan endospora pada bakteri dilakukan dengan menggunaan teknik pewarnaan. Teknik pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai endospora adalah pewarnaan Endospora.

B. Prinsip Pewarnaan Endospora

Struktur endospora tersusun oleh protein keratin kompleks, sehingga sulit untuk diwarnai dengan pewarna biasa. Jenis pewarna yang dapat menembus dan mewarnai endospora adalah Malachite green atau Carbolfuchsin.

C. Tipe Endospora Bakteri

Endospora yang terbentuk pada permukaan dinding sel bakteri mempunyai variasi tipe berdasarkan lokasi pembentukannya. Hal ini juga berkaitan dengan spesies bakteri. Endospora dapat terbentuk pada bagian terminal (ujung sel), subterminal (agak tepi atau diantara tengah dan tepi) dan central (tengah).

D. Macam-Macam Metode Pewarnaan Endospora Bakteri

Metode pewarnaan endospora secara umum ada 2 macam, yang dibedakan berdasarkan jenis reagen pewarna dan sifat zat warna yang digunakan. Kedua metode tersebut dinamakan metode Schaeffer-Fulton dan metode Dorner.

1. Pewarnaan Endospora Metode Schaeffer-Fulton 

Metode Scaeffer-Fulton sering digunakan di lab-lab pengujian, dan menjadi salah satu teknik dasar identifikasi spesies bakteri. Metode ini cukup simpel, mudah digunakan dan cepat untuk mengidentifikasi bakteri.

Metode Scaeffer-Fulton menggunakan 2 macam reagen warna yaitu Malachite green sebagai pewarna primer dan  Safranin sebagai pewarna sekunder. Tidak ada reagen dekolorisasi khusus yang digunakan untuk melarutkan pewarna.

Malachite green hanya akan berikatan dengan struktur endospora bakteri dan memberi warna hijau, sedangkan Safranin akan berikatan dengan bagian dinding sel yang tidak membentuk endospora dan akan memberi warna merah. 

Malachite green mudah berikatan dengan endospora karena dibantu dengan proses pemanasan, selain itu juga Malachite green memiliki level pH tinggi antara 11 - 11,2 dan bersifat larut dalam air. Perbedaan warna yang kontras akan mempermudah dalam mengamati struktur endospora dan sel vegatif yang tidak membentuk endospora. 

2. Pewarnaan Endospora Metode Dorner 

Metode pewarnaan Dorner menggunakan pewarna Carbolfuchsin yang memberi warna merah ketika berikatan dengan endospora bakteri. Pewarna sekunder yang digunakan adalah Nigrosin yang memberi warna hitam.

Berbeda dengan metode Scaeffer-Fulton, pewarna sekunder yang digunakan dalam metode Dorner tidak mewarnai sel vegetatif tetapi mewarnai lingkungan sel. Dinding sel vegetatif tampak jernih / transparan di tengah pewarna Nigrosin yang gelap.

E. Komposisi Reagen Pewarnaan Endospora Bakteri

1. Komposisi Pewarna Endospora Metode Schaeffer-Fulton 

Reagen	Komposisi
Malachite green	Malachite green 0,5 g, Akuades steril 100 ml
Dekolorizer (air)	Akuades steril
Safranin	Safranin 2,5 g, Etanol 95% 100 ml

2. Komposisi Pewarna Endospora Metode Dorner

Reagen	Komposisi
Carbolfuchsin	Fuchsin dasar 0,3 g, etanol 95% 10 ml, Fenol 5 ml, Akuades steril 95 ml
Dekolorizer (alkohol asam)	Etanol 95% 97 ml, Asam hidroklorit 3 ml
Nigrosin	Nigrosin 10 g, Akuades steril 100 ml

F. Prosedur Pewarnaan Endospora

1. Prosedur Pewarnaan Endospora Metode Schaeffer-Fulton 

1. Siapkan alat dan bahan yang digunakan seperti kaca preparat bersih, jarum ose, hot plate, panci alumunium, penangas, kertas merang, bunsen, set reagen pewarna, akuades steril dan kultur murni bakteri dari medium agar.
2. Teteskas 1 tetes kecil akudes steril diatas permukaan kaca preparat menggunakan jarum ose. 
3. Secara aseptis ulaskan kultur murni bakteri pada tetesan akuades steril menggunakan jarum ose dan dan ratakan.
4. Kering anginkan ulasan bakteri dan fiksasi panas dengan cara melewatkan permukaan bawah kaca preparat di atas api bunsen sebanyak 2-3 kali. Fungsinya adalah untuk mematikan merangsang terbentuknya endospora dan untuk mematikan sel bakteri tanpa merusak struktur dinding sel.
5. Tutup permukaan ulasan bakteri dengan potongan kecil kertas merang atau menggunakan kertas yang dapat menyerap air (bukan tissue).
6. Letakkan kaca preparat diatas penangas + panci yang berisi air yang telah didihkan dengan hot plate. Uap air panas yang dihasilkan akan memberi panas pada kaca preparat.
7. Banjiri kertas merang dengan meneteskan pewarna Malachite green dan diamkan selama 5 menit. Apabila pewarna mulai mengering karena menguap dapat ditetesi kembali.
8. Setelah 5 menit, angkat kaca prepat dengan pinset dan bilas pewarna dengan akuades steril.
9. Keringkan hasil bilasan dengan tissue dan hindari untuk mengelap ulasan bakteri secara langsung.
10. Setelah kering teteskan Safranin secara merata diatas ulasan bakteri, dan tunggu selama 30 detik.
11. Bilas pewarna dengan akuades steril dan keringkan seperti lagkah no. 9.
12. Tutup ulas bakteri dengan cover slide dan amati hasil pewarnaan dibawah mikroskop cahaya. 

2. Prosedur Pewarnaan Endospora Metode Dorner

1. Siapkan alat dan bahan yang digunakan seperti kaca preparat bersih, jarum ose, hot plate, panci alumunium, penangas, kertas merang, bunsen, set reagen pewarna, akuades steril dan kultur murni bakteri dari medium agar.
2. Teteskas 1 tetes kecil akudes steril diatas permukaan kaca preparat menggunakan jarum ose. 
3. Secara aseptis ulaskan kultur murni bakteri pada tetesan akuades steril menggunakan jarum ose dan dan ratakan.
4. Kering anginkan ulasan bakteri dan fiksasi panas dengan cara melewatkan permukaan bawah kaca preparat di atas api bunsen sebanyak 2-3 kali. Fungsinya adalah untuk mematikan merangsang terbentuknya endospora dan untuk mematikan sel bakteri tanpa merusak struktur dinding sel.
5. Tutup permukaan ulasan bakteri dengan potongan kecil kertas merang atau menggunakan kertas yang dapat menyerap air (bukan tissue).
6. Letakkan kaca preparat diatas penangas + panci yang berisi air yang telah didihkan dengan hot plate. Uap air panas yang dihasilkan akan memberi panas pada kaca preparat.
7. Banjiri kertas merang dengan meneteskan pewarna Carbolfuchsin dan diamkan selama 5-10 menit. Apabila pewarna mulai mengering karena menguap dapat ditetesi kembali.
8. Setelah 5-10 menit, angkat kaca prepat dengan pinset dan bilas pewarna dengan meneteskan larutan alkohol asam, dan ditunggu selama 1 menit.
9. Selanjunnya bilas dengan akuades steril.
10. Keringkan hasil bilasan dengan tissue dan hindari untuk mengelap ulasan bakteri secara langsung.
11. Setelah kering teteskan Nigrosin di ujung kaca preparat, dan ulas / smear merata dengan menggunakan kaca preparat lainnya secara perlahan. Tunggu hingga agak kering.
12. Hasil pewarnaan dibawah mikroskop cahaya.

 

G. Interpretasi Hasil Pewarnaan Endospora Bakteri

Metode Pewarnaan	Endospora	Sel Vegetatif
Scaeffer-fulton	Hijau	Merah
Dorner	Merah	Transparan / jernih

H. Sumber & Referensi

• Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta. 
• Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H and Stahl, D.A. 2015. Brock Biology of Microorganism 14 th edition. Pearson Education, US. 
• Microbeonline.com
• Microbenotes.com
• Microbiologyinfo.com
• Oktari, A., et. al. The Bacterial Endospore Staining on Schaeffer Fulton Using Variation of Methylene Blue Solution. J. Phys. Conf., 812 (2017) 012066. DOI:  10.1088/1742-6596/812/1/012066
  
• Pelczar, M.J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.

Follow

MicrobeHolic Situs berbagi ilmu Biologi dan Mikrobiologi. Silahkan follow situs ini untuk mendapatkan update terbaru.

Share this post