Polymerase Chain Reaction (PCR): Prinsip dan Tipe PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik Biologi Molekuler yang digunakan untuk menggandakan pita DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) atau RNA (Ribo Nucleic Acid) secara invitro (diluar sel). Teknik PCR telah dikembangkan sejak tahun 1984 oleh seorang ahli Biokimia asal Amerika bernama Kary B. Mullis. Teknologi PCR waktu itu sangat bermanfaat dalam kedokteran atau bidang biomedis untuk mendeteksi suatu penyakit yang disebabkan oleh virus salah satunya adalah HIV. Sebagai bentuk penghargaan,  pada tahun 1993 Kary B. Mullis mendapat hadiah Nobel untuk kategori bidang Kimia. 

{tocify} $title={Daftar isi}

A. Prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction)

Prinsip utama PCR adalah menggandakan untai DNA melalui alat yang bernana thermal cycler. Thermal cycler merupakan alat yang dapat mengatur suhu rendah dan tinggi secara kontinyu serta dapat diulang-ulang sesuai kebutuhan. Suhu digunakan untuk menjalankan reaksi berantai dalam mengganadakan untai DNA atau RNA.

Teknik PCR hingga saat ini telah mengalami perkembangan sangat pesat, baik dari segi metode maupun teknologi yang digunakan. Teknik ini menjadi prosedur yang esensial dalam rangka meningkatkan kesehatan dan taraf hidup manusia misalnya saat terjadi wabah virus global seperti Covid-19.  Selain itu teknik PCR juga sangat berguna untuk mengeksplorasi genom makhluk hidup seperti human genome project yang telah dilakukan pada tahun 2003 lau, atau mendiagnosis penyakit-penyakit yang disebabkan oleh infeksi mikroorgnisme seperti bakteri, protozoa, fungi dan virus). 

B. Tipe-Tipe PCR (Polymerase Chain Reaction)

Dalam praktiknya PCR mempunyai berbagai tipe berdasarkan metode yang digunakan, dan yang sering digunakan diantaranya:

1. Real-Time PCR / RT-PCR / quantitative PCR / qPCR
2. Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)
3. Reverse-Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR)
4. Nested PCR
5. Multiplex PCR
6. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR

 

1. Real-Time PCR / RT-PCR / quantitative PCR / qPCR

Real-Time PCR / qPCR atau disebut quantitive PCR adalah metode amplifikasi DNA yang melibatkan proses kuantifikasi DNA hasil PCR secara langsung untuk menegetahui konsentrasinya. PCR konvensional biasanya menggunakan elektroforesis gel agarosa untuk memvisualisasikan produk PCR, sedangkan qPCR sudah secara langsung difasilitasi analisis produk PCR yang real time saat fase eksponensial reaksi. 

Prinsip utama Real-Time PCR adalah menggunakan biomarker berupa pewarna fluorescent untuk memberi pelabelan pada oligonukleotida yang akan ditambahkan pada reaksi. Konsentrasi produk hasil PCR berupa pita DNA ditampilkan berupa grafik pada layar komputer sebagai dasar analisis. qPCR diaplikasikan dalam studi genotiping dan kuantifikasi patogen, microRNA, deteksi kanker, rapid-test bakteri dan virus, dan deteksi organisme yang direkayasa (GMO).

2. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

Teknik dasar yang digunakan dalam Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR) adalah modifikasi dari PCR konvensional. Molekul RNA sebagai template dikonvermasi menjadi DNA komplementer (cDNA) sebelum diperbanyak (amplifikasi). Konversi RNA menjadi cDNA digenerasi menggunakan enzim reverse transcriptase, sehingga dapat menjadi template reaksi. RT-PCR biasa digunakan dalam metode penelitian penyisipan gen, diagnosa penyakit yang berhubungan dengan virus RNA dan kanker.

3. Reverse Transcriptase Real Time PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR secara teknis adalah gabungan dari kedua metode yaitu RT-PCR dan qPCR yang melakukan konversi RNA ke cDNA sekaligus melakukan kuantifikasi produk.

4. Nested PCR

Nested PCR merupakan modifikasi dari teknik PCR untuk meningkatkan spesifisitas untuk memperoleh produk yang spesifik. Modifikasi dilakukan dalam penggunaan primer saat reaksi. Pada teknik konvensional hanya digunakan 1 pasang primer, namun pada nested PCR menggunakan 2 pasang primer berbeda (A dan B) serta melibatkan 2 tahap reaksi amplifikasi. 

Reaksi pertama, sepasang primer pertama (A) akan mengamplifikasi DNA template diluar dari fragmen target dalam jumlah yang besar. Produk amplifikasi reaksi pertama digunakan sebagai template baru pada reaksi kedua yang diamplifikasi oleh sepasang primer kedua (B) pada bagian spesifik pada DNA target. Penggunaan 2 pasang primer oligonukleotida dapat meningkatkan siklus dan sensitifitas reaksi PCR, serta efisien untuk mengamplifikasi DNA target dari template DNA yang panjang.

5. Multiplex PCR

Multiplex PCR digunakan untuk mengamplifikasi banyak target fragmen DNA dalam satu kali reaksi PCR. Kuncinya adalah penggunaan primer dalam jumlah banyak yang telah dioptimasi berdasarkan suhu terbaik dari masing-masing primer. 

Metode ini biasanya diaplikasikan dalam banyak studi genotiping, mutasi, dan analisis polimorfisme, analisis STR (Short Tandem Repeat) mikrosatelit, deteksi patogen dan GMO. Di laboratorium dapat digunakan sebagai dasar membedakan terhadap jenis-jenis bakteri penyebab penyakit yang sama.

6. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR

RFLP PCR menggunakan metode amplifikasi selektif pada fragmen DNA yang telah dipotong-potong untuk menggenerasi suatu sidik jari (fingerprint) unik pada genom organisme yang dikehendaki. Metode ini dapat menggenerasi fragmen penanda (marker) dari berbagai organisme secara cepat, tanpa diketahui sekuen genom sebelumnya.

RFLP PCR menggunakan enzim restriksi untuk memotong pita DNA genom yang menghasilkan bagian ujung DNA yang lengket. Fragmen DNA yang telah terpotong akan diamplifikasi oleh sepasang primer dan hasilnya akan tampak setelah divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa. Metode ini banyak diaplikasikan dalam studi keragaman genetik spesies, hubungan filogenetik dalam suatu populasi, dan pemetaan genetik setiap kultivar.

C. Sumber & Referensi

• Green, M.R. dan Sambrook, J. 2019. Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harbour Protocol 2019(2); pdb.prot095182. DOI: 10.1101/pdb/prot095182.
• Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H and Stahl, D.A. 2015. Brock Biology of Microorganism 14 th edition. Pearson Education, US.
• Solanki, G. 2012. Polymerase Chain Reaction. International Journal of Pharmacological research, Vol 2 (3). DOI: 10.7439/ijpr.v2i3.514.

Follow

MicrobeHolic Situs berbagi ilmu Biologi dan Mikrobiologi. Silahkan follow situs ini untuk mendapatkan update terbaru.

Share this post